A kutatócsoport a 2021-11-01 - 2025-10-31. közötti időszakban az NKFIH által támogatott projekt (137600-K) keretében a Septin7 fehérje vázizmok regenerációjában betöltött szerepének a vizsgálatát tűzte ki célul. Ennek keretében az alábbi specifikus kérdésekre keressük a válaszokat:
- A citoszkeletális szeptin fehérjék expressziójának vizsgálata izomból származó sejttenyészetekben.
Alkalmazott módszerek: sejttenyésztés, életképességi és proliferációs vizsgálatok, RNS- és fehérje izolálás, Western blot, RT-PCR és qPCR, immuncitokémia, konfokális mikroszkópia, shRNS-indukált géncsendesítés, génmódosítás Crispr/Cas9 módszerrel, fehérjék overexpressziója expressziós vektorok segítségével, plazmidok szaporítása kompetens baktériumok közvetítésével.
- A citoszkeletális septin fehérjék kifejeződésének vizsgálata emlősök vázizmaiban.
Alkalmazott módszerek: vázizmok preparálása rágcsálókból, RNS- és fehérje izolálás, Western blot, RT-PCR és qPCR, fagyasztott és paraffinba ágyazott izomminták és abból metszetek készítése immunhisztokémiához, egyedi izomrostok előállítása enzimatikus emésztést követően, immuncitokémia, konfokális mikroszkópia, szövetspecifikus génmódosítás Cre/Lox módszerrel, genotipizálás izolált DNS-ből, fehérjék overexpressziója expressziós vektorok segítségével elektroporációt követőn.
- A Septin7 fehérje kifejeződésének csökkentése hogyan befolyásolja az in vivo és in vitro izomteljesítményt?
Alkalmazott módszerek: in vivo mérések (Grip teszt, önkéntes futás vizsgálata), preparált vázizmokon elektromos ingerléssel kiváltott összehúzódások vizsgálata.
- A septin7 fehérje szerepének meghatározása az izomregenerációban kontroll és Septin7 módosított egerekben.
Alkalmazott módszerek: regenerációt indukáló izomsérülések kialakítása BaCl injektálással, vázizmok preparálása rágcsálókból, RNS- és fehérje izolálás, Western blot, RT-PCR és qPCR, fagyasztott és paraffinba ágyazott izomminták és abból metszetek készítése immunhisztokémiához, immuncitokémia, konfokális mikroszkópia, regenerációs markerek vizsgálata molekuláris biológiai módszerekkel.
- A Septin7 fehérje kifejeződésének detektálása a differenciálódás és egyedfejlődés előrehaladtával.
Alkalmazott módszerek: sejttenyésztés, vázizompreparálás, RNS- és fehérjeminták készítése, Western blot, qPCR, immuncitokémia, konfokális mikroszkópia.
- A septin7 fehérje szerepének meghatározása az izomregenerációban a Duchenne izomdisztrófia egérmodelljének tekinthető MDX egerekben.
Alkalmazott módszerek: regenerációt indukáló izomsérülések kialakítása BaCl injektálással, vázizmok preparálása rágcsálókból, RNS- és fehérje izolálás, Western blot, RT-PCR és qPCR, fagyasztott és paraffinba ágyazott izomminták és abból metszetek készítése immunhisztokémiához, immuncitokémia, konfokális mikroszkópia, regenerációs markerek vizsgálata molekuláris biológiai módszerekkel.
- A Septin7 génmódosítás hatása a vázizmok struktúrájára és funkciójára.
Alkalmazott módszerek: preparált vázizmok előkészítése elektronmikroszkópos vizsgálathoz, transzmissziós EM képek készítése és feldolgozása, immuncitokémia, ionáramok mérése voltage clamp technikával, intracelluláris kalciummérések fluoreszcens, kalciumérzékeny festékek alkalmazásával.
- Septin7 expresszió csökkenés hatása a mitokondriális morfológiára és funkcióra sejttenyészeteken és vázizmokban.
Alkalmazott módszerek: mitokondriumok jelölése speciális festékekkel, immuncitokémia, konfokális mikroszkópia, membránpotenciál mérése festékek alkalmazásával, RNS- és fehérje izolálás, Western blot, qPCR, mitokondriális komplexek funkcionális vizsgálata Seahorse mérőrendszerrel és komplex-specifikus esszék segítségével.
- A citoszekeletális septinek, elsősorban a Septin7 szerepének feltérképezése vázizmok kalciumhomeosztázisában.
Alkalmazott módszerek: RNS- és fehérje szintű vizsgálatok az elektomechanikai kuplungban szabályozó szereppel bíró fehérjékre vonatkozóan (pl. STIM1, Orai1), egyedi izolált vázizomrostokon intracelluláris kalciummérések kivitelezése CoolLed mérőrendszerrel és konfokális mikroszkóppal, fáradási protokollok alkalmazása és ionáramok elektrofiziológiai vizsgálata, immuncitokémia.
- A Septin7 fehérjekapcsolatainak feltérképezése izomeredetű sejtvonalon és emlős vázizomban.
Alkalmazott módszerek: sejttenyésztés, vázizmok és egyedi rostok preparálása, Western blot, immuncitokémia, ko-immunprecipitációs minták készítése és vizsgálata tömegspektroszkópiával.
- A citoszkeletális septinek kifejeződésének vizsgálata myopátiás betegekből származó humán izommintákon.
Alkalmazott módszerek: RNS izolálás, qPCR, immunhisztokémia.
- Fluoreszcensen jelölt Septin7 fehérje kifejeződésének vizsgálata sejttenyészeteken és vázizomban.
Alkalmazott módszerek: bakteriális transzformáció, plazmid izolálás baktériumból, sejttenyésztés, lipid-mediált transzfekció, elektroporáció, immuncitokémia, konfokális mikroszkópia.
- Septin7 szerepének meghatározása miogén sejtek migrációjában.
Alkalmazott módszerek: sejttenyésztés, migráció vizsgálata Cytosmart és OperaPhenix mérőrendszerek segítségével, migrációs paraméterek meghatározása MatLab software alkalmazásával, RNS- és fehérjeminták előkészítése és feldolgozása Western blottal és qPCR-ral, immuncitokémia, konfokális mikroszkópia, intracelluláris kalciummérés fluoreszcens festékekkel.